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jueves, 26 de enero de 2012

LEISHMANIOSIS (III)



LEISHMANIOSIS (III)

LA VACUNA: CANILEISH

La fabricación de esta vacuna se ha basado en una línea de investigación que se inicia a principios de los años 90, que consistió en una nueva y revolucionaria manera de reproducir el ciclo biológico completo de los parásitos de Leishmania sin la utilización de animales de experimentación.
Se consigue así un sistema de cultivo sin suero ni células, que permitió no solo producir todos los estadios del desarrollo del parásito sino que también se pudo conseguir un sistema de producción del mismo considerablemente más rápido al mismo tiempo que se mantenían sus propiedades virulentas y antigénicas. Además, DADO EL EXCLUSIVO MEDIO DE CULTIVO UTILIZADO, TODAS LAS PROTEÍNAS DEL SOBRENADANTE SON PRODUCTOS DEL PARÁSITO. Son las llamadas proteínas secretadas-excretadas o PSE.

Es en 1998 cuando se decide evaluar el uso potencial de los antígenos PSE junto con un adyuvante para la vacunación inmunoterapéutica en casos de leishmaniosis canina clínica. Todo el trabajo previo de los efectos de las PSE sobre el equilibrio inmune había sido realizado en ratones y los resultados fueron prometedores.
Se consiguen así resultados alentadores en un pequeño ensayo de casos clínicos que indicaban que las proteínas PSE podían acabar desplazando la respuesta inmune hacía un tipo Th 1 (os recuerdo: RESPUESTA CELULAR) más apropiado y también mejorar la salud global de los perros. Las pruebas experimentales y de campo con un prototipo de vacuna PSE formulada con el adyuvante MDP en perros sanos también dieron resultados positivos, indicando que estas proteínas podrían proteger frente a la leishmaniosis canina.

Posteriormente, el adyuvante MPD es sustituido por el QA-21, que ofrece mejor tolerancia y es conocido por estimular la respuesta inmune tipo Th 1. Este tipo de adyuvantes poseen una rara habilidad de estimular una inmunidad mediada por células además de una inmunidad humoral con dosis bajas. Su capacidad excepcional para estimular la respuesta Th 1 y la producción de linfocitos T citotóxicos los hace ideales para vacunas dirigidas a parásitos intracelulares. Este adyuvante es el mismo que se utiliza en la vacuna de la malaria en la especie humana que está en la fase III de ensayos.

Las PSE son proteínas excretadas-secretadas por los parásitos, y  tienen, entre otras funciones, su contribución a la infección de la célula por parte del parásito y la multiplicación intracelular posterior además de la modulación de la respuesta inmune del hospedador. Resulta sumamente importante que el sistema inmune procese estas proteínas para estimular la proliferación de linfocitos T. Se demostró que las PSE estimulan mejor la proliferación de linfocitos T que las proteínas brutas del parásito. Había que conseguir fraccionar las más de 2000 proteínas de la leishmania y utilizar sólo las PSE (50-100 proteínas) en la fabricación de la vacuna, que es lo que se hizo.

El objetivo primario de la vacunación contra cualquier enfermedad protozoaria es el MINIMIZAR EL NÚMERO DE PERROS VACUNADOS QUE PROGRESA HACIA UN ESTADIO DE ENFERMEDAD SINTOMÁTICA. Estos perros, aunque no aparenten sufrir la enfermedad y por ello no sean motivo de preocupación a menos que el propietario tenga conciencia de ello, siguen siendo infecciosos para el vector y, en consecuencia, siguen contribuyendo de forma considerable a la epidemiología de la enfermedad. También tienen el riesgo de progresar hacía el estadio sintomático.

Para poder conseguir estos objetivos, el principal requisito para una vacuna contra la leishmaniosis canina es que induzca una inmunidad sólida, específica y mediada por células apropiada para un patógeno intracelular. Una respuesta como esta será capaz de reconocer el antígeno (leishmania) y desarrollar una MEMORIA INMUNOLÓGICA DE LARGA DURACIÓN CON UNA FUERTE POLARIDAD Th 1 que, a su vez, podrá desencadenar una respuesta activa eficaz con predominio Th 1 en los encuentros posteriores con el parásito. Es decir, de lo que se trata cuando vacunamos a los perros con estas proteínas y su adyuvante, es dotar al organismo, a través de un proceso de memorización celular, de la capacidad de matar al parásito si es que un día el perro es picado por un flebotomo y le inocula leishmanias, o lo que es lo mismo: ESTIMULACIÓN ESPECÍFICA DE UNA INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS CON RESPUESTA MEMORIA Th 1.

Es evidente que cuando se crea una vacuna hay que demostrar su eficacia, y para esto es necesario ensayarla en el perro. Para esto se realizaron dos tipos de ensayos:
-Modelo de desafío EXPERIMENTAL diseñado para demostrar la duración de la inmunidad.
-Ensayo en estación en el que se expuso a los perros a presiones elevadas y continuadas de infección NATURAL a lo largo de dos temporadas de transmisión.
En circunstancias normales, la prueba definitiva para una vacuna, y requerida para su registro, es un estudio de desafío experimental. Sin embargo, la producción de un modelo de desafío adecuado para esta enfermedad, es un desafío en sí mismo.

Se utilizaron veinte perros de seis meses de edad sin contacto previo con leishmania. Se sometió a diez perros al programa normal de vacunación de tres inyecciones a intervalos de tres semanas. Se formuló la vacuna para que contuviera un 10% menos de antígeno que una dosis comercial normal, requerimiento para el estudio de los modelos de eficacia con fines de registro. Otros diez perros sirvieron de control sin vacunación. Había cinco machos y cinco hembras en cada grupo.

Un año después del programa de vacunación inicial, momento en el que se debería aplicar un refuerzo (cosa que no se hizo), todos los perros se sometieron a un desafío mediante inyección intravenosa de una alta dosis de promastigotes de leishmania altamente virulentos.

Se siguió de cerca el estado clínico de cada uno de los perros durante el año siguiente. Se examinó su médula ósea (punción) en varios momentos para la realización de PCR cuantitativa para detectar ADN del parásito y también se realizaron cultivos para comprobar la presencia de parásitos vivos. También se realizaron pruebas para evaluar la respuesta inmune humoral y la mediada por células.
PORCENTAJE DE PERROS PCR POSITIVA DURANTE LA FASE DE DESAFÍO (la semana 0 (S0) es un año después de la última vacunación e inmediatamente antes de la inoculación de los promastigotes de leishmania)


DESGLOSE DE RESULTADOS:

-EN EL GRUPO CONTROL (No vacunados)
 -Siete perros tuvieron resultados positivos a la PCR y cultivo, y permanecieron así durante el resto del estudio.
 -Dos perros tuvieron resultados positivos para PCR la semana 15 pero mantuvieron cultivos negativos; uno de ellos dio PCR negativa a la semana 23 y el otro dio negativo a la semana 32.
 -Un perro tuvo un resultado positivo para PCR al final del estudio pero mantuvo cultivos negativos.
 -Ningún perro bloqueó completamente el desafío antes de que el parásito de extendiera a la médula ósea.

¿Qué quiere decir esto?:

 -SIETE PERROS TUVIERON UNA INFECCIÓN ACTIVA ASINTOMÁTICA (PCR + y cultivos +), UN PERRO FUE POSITIVO SOLO A ADN (PCR + y cultivo negativo) Y DOS PERROS SE MANTUVIERON LIBRES DE LEISHMANIA (PCR + y cultivos negativos).

-EN EL GRUPO VACUNADO:

 -Cinco perros tuvieron resultados positivos para PCR y cultivo. Tres de ellos permanecieron así durante el resto del estudio, MIENTRAS QUE DOS PUDIERON CONTROLAR LA INFECCIÓN Y TENER RESULTADOS NEGATIVOS TANTO PARA PCR COMO PARA CULTIVO AL FINAL DEL ESTUDIO.

 -Dos perros tuvieron resultados positivos para PCR la semana 15 pero mantuvieron cultivos negativos, y ambos pasaron a tener resultado negativo para PCR  a la semana 23.

 -Tres perros bloquearon completamente el desafío y permanecieron negativos para todas las pruebas a lo largo del estudio.

¿Qué quiere decir esto?

-TRES PERROS TUVIERON UNA INFECCIÓN ACTIVA ASINTÓMATICA, MIENTRAS QUE SIETE PERROS SE MANTUVIERON LIBRES DE LEISHMANIA.

Es especialmente notable que tres de los perros vacunados permanecieran negativos para ambas pruebas a lo largo del estudio. El número extremadamente elevado de parásitos administrado intravenosamente hace que fueran rápidamente detectables en la médula ósea. Además, la PCR sigue pudiendo detectar fragmentos de parásito que permanecen en la médula ósea durante un tiempo después de que hayan muerto. Esto hizo que TODOS los perros control dieran positivo al menos en una ocasión en este estudio. Quedo claro, que dadas las condiciones del estudio, la vacuna demostró una importante eficacia. Además, hay que tener en cuenta que el ensayo se realizó justo en el momento en que correspondería la revacunación de los perros, cosa que no se hizo, lo que sirvió para demostrar que la vacuna inmuniza como mínimo un año.
En la foto que podéis ver, se demuestra además que la carga parasitaria que había en la médula de los perros no vacunados, era mucho más alta que en los vacunados.




DESAFIO NATURAL

Se trataba de reproducir las condiciones de campo, es decir a las que se puede enfrentar un perro a lo largo de su vida, ya que a lo largo de ella, los perros no están expuestos a un desafío de dosis única elevada sino a múltiples picaduras infectadas a lo largo de un periodo prolongado durante  las temporadas de transmisión.

Este estudio incluyo a 90 perros de raza Beagle (46 vacunados y 44 controles) de aproximadamente 6 meses de edad. Se trataba de animales obtenidos en áreas libres de leishmania y se confirmó que eran seronegativos para esta enfermedad y para Ehrlichia al comenzar el estudio.
Entre tres y cuatro semanas después de haber completado el programa de vacunación todos los perros fueron trasladados a instalaciones a cielo abierto situadas en zonas altamente endémicas (cerca de Nápoles y de Barcelona). El programa se inició en julio en Italia y en junio en España. No se les suministró ningún tratamiento repelente para flebotomos, aunque sí se usaron productos contra pulgas y garrapatas.
80 perros completaron el estudio (41 vacunados y 39 controles), ya que a lo largo del periodo de seguimiento de dos años, diez perros murieron por causas no relacionadas con la leishmaniosis. Dado que dos de los perros que murieron en España, parece ser que lo fueron por leptospirosis, a pesar de estar vacunados, se introdujo una vacunación semestral contra esta enfermedad.

El estudio fue ciego y los investigadores clínicos y el personal que realizó los análisis en el laboratorio desconocían a qué grupo pertenecían los perros.

Durante el estudio se monitorizó de forma regular la condición clínica de los perros.

Para evaluar el estado respecto a la Leishmania se realizaron las pruebas nested PCR (nPCR) y qPCR sobre médula ósea, y el cultivo con aspirado de ganglio linfático (Italia) y médula (España).

La naturaleza altamente variable del resultado de la exposición al parásito hace que la clasificación sea todo un reto. La infección activa sintomática es relativamente fácil de clasificar, igual que un perro completamente libre de parásito. EL PROBLEMA RADICA EN LA DEFINICIÓN DE UN PERRO QUE HA SIDO EXPUESTO AL PARÁSITO PERO NO PRESENTA SIGNOS CLÍNICOS.

La presencia de ADN del parásito en la médula (PCR +) confirma que el perro ha tenido contacto con el parásito y sugiere que el parásito ha sobrevivido el tiempo suficiente para extenderse desde la piel a la médula ósea. Sin embargo, SE SABE QUE LOS RESULTADOS POSITIVOS A PCR OBTENIDOS DE MÉDULA ÓSEA DURANTE O POCO DESPUÉS DE LA EXPOSICIÓN DE UN PERRO PUEDEN IR SEGUIDOS DEL RESTABLECIMIENTO DE RESULTADOS NEGATIVOS. Este establecimiento ocurre cuando un perro resistente es capaz de eliminar el parásito a pesar de la extensión inicial hacia médula ósea. Además, las PCR + de médula ósea no revelan si el parásito está vivo o muerto, de modo que no puede constituir una evidencia de infección activa por sí misma. ES POR ESTO QUE LA PCR NO ESTÁ RECOMENDADA COMO PRUEBA DE CRIBA RUTINARIA EN PERROS SANOS. No obstante, la presencia de parásitos en cultivo de médula ósea en perros asintomáticos, confirma la presencia de parásitos vivos activos y estos perros son clasificados como infección activa asintomática.  Resulta muy infrecuente que un perro viaje en dirección contraria y elimine el parásito una vez que ha alcanzado esta fase.

Los perros que dan positivo de forma repetida a PCR y que luego tienen cultivos positivos se encuentran claramente en progresión hacia el estado de enfermedad.

Los perros que dan positivo a PCR y luego se vuelven negativos está claro que están consiguiendo el control del parásito.

De esta forma puede seguirse el progreso de los perros a lo largo de un periodo de dos años y evaluar la diferencia entre perros vacunados y perros control.

RESULTADOS AL COMPLETAR EL ESTUDIO.

-Había 80 perros en dos escenarios.
-Había 39 perros control y 41 perros vacunados.
-El 72% de los perros control (no vacunados) dieron positivo a PCR al menos en una ocasión a lo largo del estudio, lo que demuestra la validez del desafío, es decir, que fueron picados por el flebotomo que les inoculó las leishmanias.

RESUMEN DEL ESTADO DE LEISHMANIA DE LOS PERROS EN EL MES 24 (Tras dos años de exposición en un área altamente endémica)




EXISTE UNA DIFERENCIA SIGNIFICATIVA EN EL NÚMERO DE PERROS CON INFECCIÓN ACTIVA ENTRE AMBOS GRUPOS TRAS DOS AÑOS DE DESAFÍO


Puede verse, según la figura superior que, tras dos años de desafío natural intenso, existe una disminución significativa en el riesgo de progresión hacia la infección activa.

Si solo tenemos en cuenta las infecciones sintomáticas, que son las infecciones que generan mayor preocupación al propietario se observa un patrón similar. Se hace evidente un efecto estadísticamente significativo cuando revisamos tanto el número de perros sintomáticos en el mes 24.



En este estudio, LA VACUNACIÓN CON CANILEISH DISMINUYÓ APROXIDAMENTE CUATRO VECES LA PROBABILIDAD DE ESTAR ACTIVAMENTE INFECTADO Y DE PROGRESAR HACIA LAS FASES SINTOMÁTICAS. LOS RIESGOS RELATIVOS SON UNA FORMA HABITUAL DE EXPRESIÓN DEL RIESGO COMPARATIVO PARA UN ACONTECIMIENTO.

El estudio dejó claro que el 92,7% de los perros vacunados quedaron protegidos contra el desarrollo de la enfermedad.

Estos resultados confirman la eficacia de la vacuna incluso ante la posibilidad de niveles excpecionalmente elevados de desafío natural sin protección adicional contra el vector. Este estudio fue diseñado especificamente para maximizar la probabilidad de que los perros desarrollaran leishmaniosis. Los escenarios fueron elegidos expresamente para asegurar una presión de infección máxima. EN EFECTO SE OBSERVA QUE EL GRUPO CONTROL, EN EL QUE 1/3 DE LOS PERROS SE INFECTÓ DE MANERA ACTIVA Y CERCA DE 1/4 PRESENTÓ ENFERMEDAD SINTOMÁTICA EN LOS DOS AÑOS DE DURACIÓN DEL ESTUDIO. La incidencia normal de enfermedad clínica en áreas endémicas suele ser inferior al 10% a lo largo de la vida del animal.

ESTE ESTUDIO CONFIRMA QUE, INCLUSO EN EL PEOR DE LOS ESCENARIOS, CON NIVELES MUY SUPERIORES DE DESAFÍO NATURAL QUE LOS ENCONTRADOS NORMALMENTE EN PERROS DE COMPAÑÍA, LA VACUNA SIGUE SIENDO CAPAZ DE PROPORCIONAR UNA REDUCCIÓN SIGNIFICATIVA DEL RIESGO DE INFECCIÓN ACTIVA Y DE ENFERMEDAD CLÍNICA.

Además, si seguimos el estado de los individuos a lo largo del tiempo, puede observarse que, en comparación con los perros control, una proporción mayor de perros vacunados es capaz de volver al estado negativo tras haber dado positivo a PCR. Esta vacuna no solo previene la entrada del parásito en el organismo sino que orienta la respuesta inmune y hace que el animal sea más capaz de tratar el desafío recibido.

PERFIL DE SEGURIDAD
Durante la fase de vacunación no hubo reacciones generales tales como fiebre, malestar, etc, relacionadas con la vacuna. Se notaron reacciones locales comúnmente, pero se resolvieron esponteneamente en unos días tras la vacunación.

CONCLUSIÓN:
En el estudio en estación, la probabilidad de convertirse en infectado activamente y progresar hacia las fases sintomáticas de la leishmaniosis se redujo aproximadamente cuatro veces.

Foto y textos obtenidos de la monografía del producto CaniLeish, editada por Laboratorios Virbac.

José Enrique Zaldívar Laguía.

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